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Real-time qPCR如何進(jìn)行數(shù)據(jù)分析

更新時(shí)間:2023-03-21      瀏覽次數(shù):790

Real-time qPCR如何進(jìn)行數(shù)據(jù)分析


1. Real-time qPCR常見參數(shù)

基線(baseline)

通常是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)

同一次反應(yīng)中針對(duì)不同的基因需單獨(dú)設(shè)置基線

閾值(threshold)

自動(dòng)設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍

手動(dòng)設(shè)置:置于指數(shù)擴(kuò)增期,剛好可以清楚地看到熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)

同一次反應(yīng)中針對(duì)不同的基因可單獨(dú)設(shè)置閾值,但對(duì)于同一個(gè)基因擴(kuò)增一定要用同一個(gè)閾值。

Ct值:與起始濃度的對(duì)數(shù)成線性關(guān)系。

分析定量時(shí)候一般取Ct:15-35。太大或者太小都會(huì)導(dǎo)致定量的不準(zhǔn)確。

Rn(Normalized reporter)是熒光報(bào)告基團(tuán)的熒光發(fā)射強(qiáng)度與參比染料的熒光發(fā)射強(qiáng)度的比值。
△Rn:△Rn是Rn扣除基線后得到的標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果(△Rn=Rn-基線)。

2. 影響Ct值的關(guān)鍵因素

模板濃度

模板濃度是決定Ct的最主要因素。控制在一個(gè)合適范圍內(nèi),使Ct在15-35之間

反應(yīng)液成分的影響

任何分子的熒光發(fā)射都受環(huán)境因素影響----比如溶液的pH值和鹽濃度。

PCR反應(yīng)的效率

PCR反應(yīng)的效率也會(huì)影響Ct值。在PCR擴(kuò)增效率低的條件下進(jìn)行連續(xù)梯度稀釋擴(kuò)增,與PCR擴(kuò)增效率高的條件下相比,可能會(huì)所產(chǎn)生斜率不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線。PCR效率取決于實(shí)驗(yàn)、反應(yīng)混合液性能和樣品質(zhì)量。一般說來,反應(yīng)效率在90-110%之間都是可以接受的。

3. 如何評(píng)估實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)的效果

PCR擴(kuò)增效率:為了正確地評(píng)估PCR擴(kuò)增效率,至少需要做3次平行重復(fù),至少做5個(gè)數(shù)量級(jí)倍數(shù)(5logs)連續(xù)梯度稀釋模板濃度。


另一個(gè)評(píng)估PCR效率的關(guān)鍵參數(shù)是相關(guān)系數(shù)R2,它是說明兩個(gè)數(shù)值之間相關(guān)程度的統(tǒng)計(jì)學(xué)術(shù)語。如果R2等于1,那么你可以用Y值(Ct)來準(zhǔn)確預(yù)測(cè)X值(量)。如果R2等于0,你就不能通過Y值來預(yù)測(cè)X值。R2值大于0.99 時(shí),兩個(gè)數(shù)值之間相關(guān)的可信度很好。


標(biāo)準(zhǔn)偏差(standard deviation,偏差的平方根)是的精確度計(jì)量方法。

如果許多數(shù)據(jù)點(diǎn)都靠近平均值,那么標(biāo)準(zhǔn)偏差就?。蝗绻S多數(shù)據(jù)點(diǎn)都遠(yuǎn)離平均值,則標(biāo)準(zhǔn)偏差就大。實(shí)際上,足夠多重復(fù)次數(shù)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)組會(huì)形成大致的正態(tài)分布。這經(jīng)??赏ㄟ^經(jīng)典的中心極限理論來證明,獨(dú)立同分布隨機(jī)變量在無限多時(shí)趨向于正態(tài)分布。如果PCR反應(yīng)效率是 100%,那么2倍稀釋點(diǎn)之間的平均Ct間隔應(yīng)該恰為1個(gè)Ct值。要以99.7%的幾率分辨2倍稀釋濃度,標(biāo)準(zhǔn)偏差就必須小于等于0.167。標(biāo)準(zhǔn)偏差越大,分辨2倍稀釋的能力就越低。為了能夠在95%以上的情況下分辨出2倍稀釋,標(biāo)準(zhǔn)偏差必須小于等于 0.250


Real-time qPCR如何進(jìn)行數(shù)據(jù)分析

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