PI染色實(shí)驗(yàn)代測(cè)

PI染色簡(jiǎn)介：

碘化丙啶( propidium iodide,PI )檢測(cè)早期死亡細(xì)胞膜通透性狀態(tài)的不同是區(qū)分細(xì)胞凋亡和壞死的一一個(gè)重要指標(biāo),凋亡細(xì)胞在進(jìn)入最終溶解階段前,細(xì)胞膜通透性無明顯改變,相對(duì)分子質(zhì)量大的與DNA結(jié)合的熒光染料(如PI )不能進(jìn)入凋亡細(xì)胞內(nèi),而相對(duì)分子質(zhì)量小的熒光染料(如Hoechest 3342或33258等)仍能被細(xì)胞攝取。應(yīng)用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可區(qū)分和壞死細(xì)胞,細(xì)胞內(nèi)DNA出現(xiàn)Hoechest 3342 標(biāo)記而不出現(xiàn)PI標(biāo)記的為凋亡細(xì)胞。

PI染色原理：

主要是根據(jù)細(xì)胞凋亡時(shí)在細(xì)胞、亞細(xì)胞和分子水平上所發(fā)生的特征性改變。這些改變包括細(xì)胞核的改變、細(xì)胞器的改變、細(xì)胞膜成分的改變和細(xì)胞形態(tài)的改變等，其中細(xì)胞核的改變具有特征性。

PI實(shí)驗(yàn)說明：

1、PI染色拍照使用的是熒光拍照。

實(shí)驗(yàn)步驟（僅供參考）：

1、收集細(xì)胞{數(shù)目約（1~ 5）×106個(gè)/mL}，500 ~ 1000 r/min離心5min，棄去培養(yǎng)液。

2、3ml　PBS洗滌1次。

3、離心去PBS，加入冰預(yù)冷的70%的乙醇固定，4℃，1—2小時(shí)。

4、離心棄去固定液，3mlPBS重懸5min。

5、400目的篩網(wǎng)過濾1次，500—1000r/min離心5min，棄去PBS

6、用1ml　PI染液染色，4℃避光30min。

7、流式細(xì)胞儀檢測(cè)：PI用氬離子激發(fā)熒光，激光光波波長為488nm，發(fā)射光波波長大于630nm，產(chǎn)生紅色熒光分析PI熒光強(qiáng)度的直方圖也可分析前散射光對(duì)側(cè)散射光的散點(diǎn)圖。

8、結(jié)果判斷：在前散射光對(duì)側(cè)散射光的散點(diǎn)圖或地形圖上，凋亡細(xì)胞與正常細(xì)胞相比，前散射光降低，而側(cè)散射光可高可低，與細(xì)胞的類型有關(guān)；在分析PI熒光的直方圖時(shí)，先用門技術(shù)排除成雙或聚集的細(xì)胞以及發(fā)微弱熒光的細(xì)胞碎片，在PI熒光的直方圖上，凋亡細(xì)胞在G1/G0期前出現(xiàn)一亞二倍體峰。如以G1/G0期所在位置的熒光強(qiáng)度為1.0，則一個(gè)典型的凋亡細(xì)胞樣本其亞二倍體峰的熒光強(qiáng)度為0.45，可用雞和鮭魚的紅細(xì)胞的PI熒光強(qiáng)度做參照標(biāo)準(zhǔn)，兩者分別為0.35和0.7，可以確保在兩者之間的不是細(xì)胞碎片而是完整的細(xì)胞。

PI染色實(shí)驗(yàn)代測(cè)